ELISA实验工作手册@清泓生物

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质检测最重要的测定方法。这一方法的基本原理是：1）将抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；2）将抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既具备免疫活性，又具备酶的活性；3）酶可催化生成有色产物且催化频率高，可放大反应信号达到很高的敏感度。如果受检样本中有目标成分存在，就可以形成抗原抗体复合物“固相抗体-受检样品中的抗原-酶标抗体”或者“固相抗原-受检样品中的抗体-酶标抗原”。洗去游离的未结合组分和非特异性组分，加入酶特异性的反应底物，根据反应体系最终颜色深浅进行检测指标的定性或定量分析。

1.1 根据实验设计，选择和订购合适的ELISA试剂盒。

1.2 根据实验目的设计合理的样品实验排板，预留标准品，（+）和（-）对照，空白对照位置，样品位置，所有对照样品和待测样品均需要实验复孔。

1.3 实验前确认ELISA平台稳定，仪器设备正常工作，试剂耗材足够实验需要。

2.1.1 双抗体夹心法：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。

2.1.1.1 将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2.1.1.2 加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗体抗原复合物；洗涤除去未结合的物质。

2.1.1.3 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原在一个新的位点与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

2.1.1.4 加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，测定OD450nm吸光度。

2.1.1.5 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

2.1.2 双位点一步法：

2.1.2.1 在双抗体夹心法测定抗原时，如针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。

2.1.2.2 在一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度过高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

2.1.3 间接法：间接法利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。

2.1.3.1 将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2.1.3.2 加入稀释的受检血清，特异性抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他免疫球蛋白及血清中的杂质。

2.1.3.3 加入酶标抗抗体，抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

2.1.3.4 加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

2.1.3.5 本法更换不同的固相抗原，可用同一种酶标抗抗体检测各种与抗原相结合的抗体。

2.1.4 竞争法：竞争法可用于检测抗原，也可用于检测抗体。受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。检测抗体类似。

2.1.4.1 将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2.1.4.2 待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤除去未结合的杂质。

2.1.4.3 加底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深；参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量；待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

2.1.5 捕获法检测IgM抗体：血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。

2.1.5.1 将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2.1.5.2 加入稀释的血清标本，孵育后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

2.1.5.3 加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤除去未结合抗原。

2.1.5.4 加入针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤除去未结合酶标抗体。

2.1.5.5 加底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中有特异性IgM抗体存在，为阳性反应。

2.1.6 应用亲和素和生物素的ELISA：亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在主要使用的是从链霉菌中提取的链霉和素（Strepavidin）。生物素（Biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，可以显著提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用可用于间接包被，亦可用于反应放大。

2.1.6.1 间接包被：在固相上先预包被亲和素，抗体或抗原与生物素结合后，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。

2.1.6.2 反应放大：用生物素化的抗体替代ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。

2.2.1 血清：室温下待血液自然凝固20分钟，2000转离心20分钟，小心转移上清至新管。

2.2.2 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合20分钟后，2000转离心20分钟，小心转移上清至新管。

2.2.3 胸腹水、脑脊液和尿液：用无菌管收集，2000转离心20分钟，小心转移上清至新管。

2.2.4 细胞培养上清：细胞培养板2000rpm离心20分钟，用无菌管或者96孔板收集细胞培养上清。

2.2.5 细胞内成分：吸去细胞培养基，加入适量细胞裂解液，4度振摇30分钟，2000rpm离心20分钟，小心转移上清至新管。

2.2.6 标本采集后尽早进行实验；若不能马上进行试验，可将样本分装后放在-80℃保存，避免反复冻融。

2.2.7 如果样本中检测物浓度高于标准品最高值，需根据实际情况，做适当倍数稀释；需进行预实验确定合适的稀释倍数。

2.2.8 含NaN3的样品可能不能用于检测，因NaN3抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性。

2.3.1 试剂盒原理：抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4与固相单抗结合，加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，形成免疫复合物“固相抗人IL-4抗体-IL4-生物素化的抗人IL-4抗体-辣根过氧化物酶标记的亲和素”。加入显色底物，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加入终止液后变黄。测定OD450nm，绘制标准曲线，根据标准曲线求出标本中IL-4的浓度。　　

2.3.2 试剂盒组成：

2.3.2.1 抗体预包被酶标板（8×12）

2.3.2.2 冻干标准品（2支，0.5ng/支）

2.3.2.3 标准品和标本稀释液（1 瓶，20ml）

2.3.2.4 浓缩生物素化抗体（1 支）

2.3.2.5 生物素化抗体稀释液（1 瓶，16ml）

2.3.2.6 浓缩酶结合物（1 支）

2.3.2.7 酶结合物稀释液（1 瓶，16ml）

2.3.2.8 浓缩洗涤液 20×（1 瓶，50ml）

2.3.2.9 显色底物（TMB）（1 瓶，12ml）

2.3.2.10 反应终止液（1 瓶，12ml）

2.3.2.11 封板胶纸（6张）

2.3.2.12 产品说明书（1 份）

2.3.3 试剂盒操作流程：

2.3.3.1 提前30分钟从冰箱中取出试剂盒，充分平衡至室温。

2.3.3.2 标准品准备：加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要稀释制备标准曲线样品。

2.3.3.3 洗涤液准备：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)，未用完的放回4℃冰箱。

2.3.3.4 从密封袋中取出试验所需板条；未用的板条和干燥剂放回铝箔袋内，压实自封条密封口袋，放回4℃。

2.3.3.5 空白孔加入标本稀释液，其余空加入不同浓度标准品和待测标本，100ul/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90分钟。

2.3.3.6 生物素化抗体工作液准备：按当次试验所需用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)至工作浓度，当日使用。

2.3.3.7 甩尽孔内液体，在洁净吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在洁净吸水纸上拍干。洗板5次。

2.3.3.8 空白孔加入生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液，100ul/孔，用新封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育60分钟。

2.3.3.9 酶结合物工作液准备：按当次试验所需用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:30)至工作浓度，室温（22-25℃）避光放置，当日使用。

2.3.3.10 甩尽孔内液体，在洁净吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在洁净吸水纸上拍干。洗板5次。

2.3.3.11 空白孔加入酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液，100ul/孔，用新封板胶纸封住反应孔，37℃温箱避光孵育30分钟。

2.3.3.12 打开酶标检测仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

2.3.3.13 甩尽孔内液体，在洁净吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在洁净吸水纸上拍干。洗板5次。

2.3.3.14 每孔加入显色底物(TMB)，100ul/孔，37℃温箱孵育15-30分钟。

2.3.3.15 每孔加入终止液，100ul/孔，混匀后30分钟内测量OD450nm。

2.3.3.16 实验完毕后将未用完的试剂放回冰箱保存至有效期结束。

2.3.4 实验数据整理和分析：

2.3.4.1 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。

2.3.4.2 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标绘制标准曲线。通过标准曲线计算标本浓度。

2.3.4.3 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

2.3.5 试剂盒注意事项:　　

2.3.5.1 检测血液或者其他体液标本时，必须按照国家生物试验室安全防护条列执行。

2.3.5.2 试剂盒使用前保存在2-8℃。

2.3.5.3 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。使用前请1000转离心1分钟，使附着管壁或瓶盖的液体沉积到底部。取用前请用小心混匀。

2.3.5.4 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，为正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液，加热温度不要超过50℃，使用前需平衡洗涤液至室温。　　

2.3.5.5 若需要分次使用标准品，应按照一次用量分装，将其放在-70℃贮存。避免反复冻融。标准品和样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。如稀释倍数过大，必须采用多步法进行样品稀释。

2.3.5.6 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。

2.3.5.7 用微量振荡器充分轻柔混匀试剂。

2.3.5.8 标准品和样本至少做双复孔检测。

2.3.5.9 试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！

2.3.5.10 吸取样品时，移液枪吸头不应粘附多余的液体；正确加样为“45度加样”，即加样枪吸头所在直线应当与板条所在直线呈45度角，沿管壁加入；不要角度太小致使液体残留在孔壁上进而导致加样不准确；也不要将吸头伸入孔中，一方面可能接触孔底后压弯吸头，另一方面可能会将孔中的液体吹起来，导致加样不准确。

2.4.1 碳酸盐包被缓冲液：50mM碳酸缓冲液，pH 9.6，4℃保存。称取Na2CO3 0.15 克，NaHCO3 0.293克，蒸馏水溶解，定容至100 ml。

2.4.2 包被抗原

2.4.2.1 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，稀释抗原浓度为10-20μg/ml，96孔酶标板每孔加入100μl，4℃放置过夜。

2.4.2.2 第二天弃去包被液后，PBST洗涤3次，直接后续实验或者冰箱保存。

2.4.3 包被细胞

2.4.3.1 在96孔培养板上接种细胞，2E4 cells/well，37℃过夜培养。

2.4.3.2 第二天用PBS洗涤培养板2-3次。

2.4.3.3 每孔加入125μl 10% Formalin（1:10稀释），室温下固定15 min。

2.4.3.4 用灭菌水洗涤培养板3次，晾干后储藏在2- 8℃备用。

3.1 文献引用：产品的文献引用，特别是高质量的SCI文章的引用对科研实验有非常重要的参考作用。

3.2 特异性：ELISA试剂盒的特异性与试剂盒的关键组分，抗体对有关。若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，常规优先使用双单抗。

3.3 灵敏度：灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，可选择高敏感度的ELISA试剂盒。

3.4 重复性：科研工作要求实验可重复，同一批次实验复孔之间数据吻合度高，不同批次间实验数据重复性好。ELISA试剂盒板内和板间变异系数应该控制在15%以内。

3.5 简便性：在保证高质量数据的情况下，选取实验时间短，操作便利的试剂盒。

3.6 经济性：进口分装试剂盒因为省去不少物流和报关费用，与国外原装进口试剂相比价格上有比较大的优惠，而且能提供比较灵活的包装规格，特别是48T等小包装，国内进口分装比较成熟的公司仍然是一个非常好的选择。

3.7 主要ELISA试剂盒生产品牌：现主要的ELISA供应商有R&D细胞因子方面的试剂盒，Bender粘附分子方面的试剂盒，Cayman花生四烯酸类产品的试剂盒，Merck(Linco)内分泌研究方面的试剂盒，Invitrogen (Biosource)磷酸化蛋白的ELISA，动物细胞因子ELISA试剂盒等。

4.1 临床标本的收集和保存

用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：

4.1.1 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。

4.1.2 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

4.1.3 血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8 ℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70 ℃以下。

4.1.4 冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。

4.1.5 标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。

4.2 试剂准备

通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。

4.3 加血清样本及反应试剂

在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

4.4 温育

温育是ELISA测定中影响测定成败非常关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。温育这一步是临床ELISA测定中很容易出现问题的步骤。通常国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃，30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中要注意以下几点：

4.4.1 要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。

4.4.2 温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。

4.4.3 “边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为 96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常 ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），可以有助于排除“边缘效应”，提高测定的可重复性。

4.5 洗板

固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是很关键的步骤。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。

在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液， 放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、 第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板 孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。

4.6 显色

在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为3 ℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。此外，在加入底物开始显色反应前，先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定。

4.7 比色

ELISA的比色测定由酶标仪进行，比色测定需注意：

4.7.1 比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为 底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450 nm，后者为492 nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。

4.7.2 单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长 如450 nm或492 nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450 nm和非敏感波长如630 nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变 波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波 长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

4.8 结果判定

临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上，而卫生部临床检验中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。

4.9 ELISA定性测定结果判定中常用缩写

4.9.1 S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。

4.9.2 S/N或P/N：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut -off值而已。

4.10 常见问题及其可能的原因小结（非试剂盒本身的原因）

4.10.1 弱阳性质控样本检测不出

4.10.1.1 温育的时间或温度不够

4.10.1.2 显色反应时间太短

4.10.1.3 所用配制缓冲液的蒸馏水有问题

4.10.2 测定的重复性差

4.10.2.1 加样本及试剂量不准；孔间不一致

4.10.2.2 加样过快，孔间发生污染

4.10.2.3 加错样本

4.10.2.4 加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区

4.10.2.5 不同批号试剂盒中组分混用

4.10.2.6 温育时间、洗板、显色时间不一致

4.10.2.7 孔内污染杂物

4.10.2.8 酶标仪滤光片不正确

4.10.2.9 血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，出现假阳性反应

4.10.3 白板（阳性对照不显色）

4.10.3.1 漏加酶结合物

4.10.3.2 洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等

4.10.3.3 漏加显色剂A或B

4.10.3.4 终止剂当显色剂使用

4.10.4 全部孔均有显色

4.10.4.1 洗板不干净

4.10.4.2 显色液变质

4.10.4.3 加底物的吸管被酶污染

4.10.4.4 洗板液被酶污染